พันธุวิศวกรรมเป็นเทคนิคของการปรับปรุงเปลี่นแปลงสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต รวมถึงการยับยั้ง การกระตุ้นการแสดงออกของยีน และการใส่สารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตต่างชนิดเข้าไปในเซลล์ เทคนิคดังกล่าวอาจเรียกว่า เทคโนโลยีรีคอมบิแนนต์ดีเอ็นเอ (recombinant DNA
พันธุวิศวกรรม (Genetic engineering)
พันธุวิศวกรรมเป็นเทคนิคของการปรับปรุงเปลี่นแปลงสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต รวมถึงการยับยั้ง การกระตุ้นการแสดงออกของยีน และการใส่สารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตต่างชนิดเข้าไปในเซลล์ เทคนิคดังกล่าวอาจเรียกว่า เทคโนโลยีรีคอมบิแนนต์ดีเอ็นเอ (recombinant DNA technology) สิ่งมีชีวิตที่ได้รับการถ่ายยีนเข้าไปเรียกว่า transgenic organism หรือ genetically modified organism (GMO) พันธุวิศวกรรมมีขั้นตอนการดำเนินการ ดังนี้
1.การเตรียมยีนหรือดีเอ็นเอที่ต้องการ
2.การโคลนยีนหรือดีเอ็นเอ
- การนำยีนหรือดีเอ็นเอมาเชื่อมกับเวคเตอร์
- การนำเวคเตอร์ลูกผสมเข้าสู่เซลล์ผู้รับ
- การตรวจหาโคลนที่ต้องการ
- การวิเคราะห์ยีนหรือดีเอ็นเอที่โคลนได้
3.การถ่ายยีนเข้าไปในสิ่งมีชีวิต
การโคลนยีนหรือดีเอ็นเอ
การโคลน (Cloning) หมายถึงการเพิ่มปริมาณผลผลิตให้เหมือนกับต้นแบบ การโคลนยีนหมายถึงการเพิ่มปริมาณยีนให้เหมือนกับยีนต้นแบบ การโคลนเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตก็หมายถึงการเพิมปริมาณเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตต้นแบบหรือมียีโนไทป์ต้นแบบ ผลผลิตที่ได้จากการโคลนเรียกว่า โคลน(clone)
การโคลนยีนหรือดีเอ็นเอมีขั้นตอนดังนี้คือ
1. การเตรียมยีนหรือดีเอ็นเอที่ต้องการ สามารถเตรียมได้จากดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิต
การคัดเลือกท่อนยีนจากสายดีเอ็นเอบนโครโมโซม สามารถทำให้สายดีเอ็นเอถูกตัดออกเป็นท่อน ๆ ได้โดยใช้ restriction endonuclease หรือโดยใช้แรงกระแทกจาก ultrasonication แล้วจึงคัดดเลือกท่อนดีเอ็นเอที่มียีนที่เราต้องการ
2. การสังเคราะห์ เป็นการสร้างยีนขึ้นมาโดยตรง ยีนที่สังเคราะห์ขึ้นได้ครั้งแรกคือยีนของ
alanine tRNA สังเคราะห์โดยกลุ่มนักวิทยาศาสตร์ที่นำโดย Dr. Khorana ยีนของโปรตีนที่สังเคราะห์ได้เป็นครั้งแรกคือยีนของฮอโมน somatostatin ซึ่งมีกรดอะมิโนต่อกันเพียง 14 ตัวเท่านั้น สังเคราะห์โดย Dr. Itakura แห่ง City of Hope National medical Center , Duarte , California , ยีนของสาย polypeptide A และ B ของอินซูลิน ( มีกรดอะมิโน 20 และ 30 ตัวตามลำดับ ) ก็สามารถสร้างขึ้นได้ ยีนที่สังเคราะห์ขึ้นได้นี้เป็นยีนท่อนสั้น ๆ ยีนของโปรตีนและเอ็นไซม์ทั่ว ๆ ไปมักมีความยาวหลายร้อยหรือเป็นพันเบสสังเคราะห์ได้ยากมากหรือกล่าวได้ว่าสังเคราะห์ไม่ได้
3. การสร้างยีนโดยอาศัย mRNA เป็นแม่แบบการสร้างยีนโดยอาศัย mRNA เป็นแม่แบบนี้ทำได้โดยอาศัยหลัก 3 ประการ
ประการแรกเนื่องจากยีนของคนเราแม้ว่าจะมีครบทุกยีนในทุกเซลล์ของร่างกาย แต่เกิด transcription ของยีนนั้น ๆ ในเฉพาะเซลล์บางชนิดเท่านั้น เช่นยีนของฮีโมโกลบินเกิด transciption ( คือมีการสร้าง mRNA ของโกลบิน ) เฉพาะในเซลล์เม็ดเลือดแดงอ่อนเท่านั้น ภายในเม็ดเลือดแดงอ่อนจึงมี mRNA ของโกลบินและ mRNA ของโปรตีนอื่นที่จำเป็นสำหรับการดำรงชีวิตของเซลล์ แต่ส่วนใหญ่แล้วเป็น mRNA ของโกลบิน ทำให้เรามีแหล่งของ mRNA ชนิดที่จำเพาะ อีกตัวอย่างหนึ่งคือ mRNA ของ preproinsulin มีในเบต้าเซลล์ของตับอ่อนเท่านั้น เป็นต้น สรุปได้ว่าแหล่งของ mRNA ที่จำเพาะก็คือเซลล์ที่ทำหน้าที่จำเพาะในการสร้างโปรตีนชนิดนั้น ๆ เมื่อทำให้เซลล์นั้นแตกก็จะมี mRNA กับส่วนประกอบอื่น ๆ ของเซลล์ปนกันอยู่ mRNA ส่วนใหญ่มี poly (A) อยู่ที่ปลาย 3' ดังนั้นจึงสามารถแยก mRNA ออกจากส่วนอื่น ๆ ของเซลล์ได้โดยให้ poly (U) sepharose จับออกมาได้ mRNA ที่ต้องการปนอยู่กับ mRNA ชนิดอื่น ๆ
ประการที่สอง ที่ทำให้สร้างยีนโดยอาศัย mRNA เป็นแม่แบบได้คือมีการค้นพบเอ็นไซม์ reverse transciptase หรือ RNA-directed DNA polymerase ซึ่งทำหน้าที่สร้างดีเอ็นเอโดยอาศัย mRNA เป็นแม่แบบโดยตรง เอนไซม์นี้สามารถสะกัดได้จากไวรัสชนิด RNA virus เช่น avian myeloblastosis virus ( AMV )
ประการที่สาม ก็คือ อาศัยความจำเพาะของการจับคู่เบสสายดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นจะมีการเรียงตัวของเบสสอดคล้องกันกับการเรียงตัวของเบสบนสาย mRNA สายดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นโดยวิธีนี้จึงได้ชื่อว่า complementary DNA หรือ cDNA
ขั้นตอนของการสร้างยีนโดยอาศัย mRNA เป็นแม่แบบมีรายละเอียดดังนี้
1. ใส่ mRNA ลงใน medium ที่เหมาะสม มีฟอสเฟต น้ำตาล deoxyribose และเบสชนิดต่าง ๆ ครบครัน พร้อมทั้งเติมเอ็นไซม์ reverse transciptase จะเกิดการสร้างสาย DNA สายเดี่ยวคือ cDNA ที่มีการเรียงตัวของเบสสอดคล้อง ( complementary ) กับการจัดเรียงตัวของเบสบนสาย mRNA และปลาย 3' ของ cDNA จะหักพับกลับเข้ามาเล็กน้อย cDNA นี้จะหลุดออกจาก mRNA เมื่อทำให้ medium เป็นด่างแล้วจึงใส่เอ็นไซม์ DNA polymerase มาต่อปลาย 3' ของ cDNA ที่หักม้วนอยู่แล้วนั้นให้เป็น double - strand DNA ที่ปลายข้างหนึ่งจับเป็นวงแล้วจึงตัดปลายข้างที่ยังจับกันเป็นวงนั้นด้วยเอ็นไซม์ SI nuclease ( SI endonuclease ) ได้ double-strand DNA ซึ่งเป็นยีนที่ต้องการ และมีท่อน double - strand DNA ซึ่งเป็นยีนอื่น ๆ อยู่ด้วยเพราะว่า mRNA ที่ใช้เป็นแม่แบบนั้นไม่ได้เป็น mRNA ชนิดเดียวบริสุทธิ์ แต่ปริมาณส่วนใหญ่ก็จะเป็นยีนที่ต้องการเพราะเราเลือกเซลล์ที่เป็นแหล่งของ mRNA โดยที่ทราบว่าภายในเซลล์จะมี mRNA ชนิดใดเป็นส่วนใหญ่ แต่ปัจจุบันนี้มีวิธีแยก mRNA ชนิดใดชนิดหนึ่งให้บริสุทธิ์ได้จึงสามารถสร้าง cDNA ของยีนใดยีนหนึ่งที่บริสุทธิ์ได้
ดีเอ็นเอจากแหล่งต่าง ๆดังกล่าวจะต้องนำมาตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะให้มีขนาดต่าง ๆ เพื่อเชื่อมเข้ากับเวคเตอร์เอนไซม์ตัดจำเพาะที่ใช้เป็เอ็นไซม์ที่สามารถจดจำลำดับเบสบนสายดีเอ็นเอที่ตัดอาจเป็นการจดจำ 4 หรือ 6 คู่เบส ตัวอย่างเช่น EcoRI, Smal สามารถจดจำลำดับ 6 คู่เบส ส่วน Taql, Alul และ Haelll สามารถจดจำลำดับ 4 คู่เบส เป็นต้น ตัวอย่างของเอ็นไซม์ที่จุลินทรีย์ผลิตและลำดับเบสที่จดจำได้แสดงไว้ที่ตาราง
ตารางที่ 1 เอนไซม์ตัดจำเพาะชนิดต่าง ๆ
เอ็นไซม์ จุลินทรีย์ที่ผลิต ลำดับเบสและตำแหน่งที่ตัด
Alul Arthrobacter 5'- -A-G-C-T- -3'
3'- -T-C-G-A- -5'
BamHl bacillus amyloliquefaciens H 5'- -G-G-A-T-C-C- -3'
3'- -C-C-T-A-G-G- -5'
EcoRI Escherichia coli 5'- -G-A-A-T-T-C- -3' 3'- -C-T-T-A-A-G- -5'
EcoRll Escherichia coli 5'- -C-C-T-G-G- -3'
3'- -G-G-A-C-C- -5'
Haelll Haemophilus aeryptius 5'- -G-G-C-C- -3'
3'- -C-C-G-G- -5'
Hindlll Haemophilus influenzae b 5'- -A-A-G-C-T-T- -3' 3'- -T-T-C-G-A-A- -5'
Pst l Providencia sturtii 5'- -C-T-G-C-A-G- -3' 3'- -G-A-C-G-T-C- -5'
Sal l Streptomyces albus 5'- -G-T-C-G-A-C- -3' 3'- -C-A-G-C-T-G- -5'
2. การนำยีนหรือดีเอ็นเอมาเชื่อมกับ Vector เมื่อได้ดีเอ็นเอหรือยีนที่ต้องการมาแล้ว การที่จะให้ดีเอ็นเอนั้นไปรวมตัวกับดีเอ็นเอของ host cell จำเป็นต้องอาศัย vector ซึ่งได้แก่
(1) Plasmid ซึ่งเป็น Extra chromosomal DNA ของ Bacteria มีลักษณะเป็นวงแหวนมีขนาด < 10 Kb
(2). Bacteriophage มีขนาด 20 Kb
(3). Cosmid เป็น Bacteriophage รวมกับ plasmid ขนาด 40 Kb
การนำยีนหรือดีเอ็นเอมาเชื่อมกับเวคเตอร์ เช่น พลาสมิด โดนการตัดพลาสมิดด้วยเอ็นไซม์จำเพาะชนิดเดียวกันกับที่ตัดดีเอ็นเอแล้วใช้เอ็นไซม์ไลเกส ( ligase )เชื่อมดีเอ็นเอให้เข้ากับเวคเตอร์ ได้เป็นเวคเตอร์ลูกผสม
3. การนำ Recombinant vector เข้าสู่ host cells
การนำเวคเตอร์ลูกผสมเข้าสู่เซลล์ผู้รับ เช่น E. coli โดยทำให้เซลล์ผู้รับอยู่ในสภาพที่พร้อมหรือเหมาะสม เรียกว่า เซลล์คอมพีเทนต์ ( competent cell ) ซึ่งสามารถกระทำได้ด้วยการใช้สารเคมี เช่น CaCl2 , MgCl2 , CoCl2 , KCl , dimethysulfoxide ที่อุณหภูมิ 0 - 42 องศาเซลเซียส หรือใช้ไฟฟ้าเพื่อให้เกิดรูหรือช่องที่เยื่อหุ้มเซลล์ หลังจากนั้นก็นำเวคเตอร์ลูกผสมเข้าไปในเซลล์ผู้รับ เรียกกระบวนการนี้ว่า การทรานสฟอร์ม ( transformation ) และเรียกเซลล์ผู้ที่มีเวคเตอร์ลูกผสมนี้ว่า ทรานสฟอร์แมนต์ ( transformant ) เมื่อทรานสฟอร์แมนต์มีการแบ่งเซลล์เพิ่มจำนวนก็เท่ากับว่ายีนหรือดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปนั้นเพิ่มจำนวนขึ้นด้วย
4. การตรวจหาโคลนที่ต้องการ ( Identification of cells that recombination DNA Moleculesเนื่องจากดีเอ็นเอที่ใส่เข้าไปในเวคเตอร์มาจากเซลล์หรือเนื้อเยื่อเป็นดีเอ็นเอทั้งหมดในสิ่งมีชีวิตนั้น ( genomic DNA ) เมื่อตัดด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะจะมีจำนวนมากมาย หรือเป็นดีเอ็นเอที่สังเคราะห์มาจากอาร์เอ็นเอซึ่งก็มีมากมายหลายชนิดเช่นเดียวกัน เมื่อถ่ายเข้าสู่เซลล์ผู้รับแล้วจึงมีเซลล์จำนวนมากและแต่ละเซลล์ได้รับชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน เรียกว่าเป็นห้องสมุดดีเอ็นเอ ( DNA library )จึงมีความจำเป็นต้องเลือกโคลนที่มีชิ้นดีเอ็นเอหรือยีนที่ต้องการด้วยวิธีตรวจสอบ Phenotype , คัดเลือกด้วย Immuno chemical โดยใช้ antibody หรือเลือกโดยการทำ colony hybridization
การทำ Colony hybridization
การวิเคราะห์ยีนหรือดีเอ็นเอที่โคลนได้ จากผลของโคโลนีไฮบริไดเซชัน ก็สกัดพลาสมิดจากโคโลนีที่ต้องการหลังจากนั้นนำมาตรวจสอบขนาดด้วยเทคนิคอิเล็กโตรโฟริซิส เปรียบเทียบขนาดของพลาสมิดและพลาสมิดที่มีชิ้นของดีเอ็นเออยู่ (พลาสมิดลูกผสม ) การโคลนยีนในแบคทีเรียนี้นนอกจากจะเพิ่มปริมาณยีนที่โคลนได้แล้วยังสามารถทำให้แบคทีเรยสร้างโปรตีน ฮอร์โมน อินเทอเฟียรอนหรือเอนไซม์ต่าง ๆ ได้อีกด้วย
การถ่ายยีนเข้าไปในสิ่งมีชีวิต
หลังจากการโคลนยีนหรือแยกยีนที่ต้องการจากเซลล์ของสิ่งมีชีวิตชนิดหนึ่งได้แล้ว จึงนำมาใช้ประโยชน์หรือทดสอบการทำงานต่อไปโดยถ่ายยีนหรือดีเอ็นเอนั้นเข้าไปในสิ่งมีชีวิตที่ต้องการ ในขั้นตอนนี้ต้องเติมโปรโมเตอร์ ( promoter ) ซึ่งเป็นส่วนของยีนในยูคาริโอต โปรคาริโอตหรือไวรัสเข้าไปยังชิ้นดีเอ็นเอที่โคลนได้ เพื่อให้ยีนแสดงออกหรือสามารถทำงานได้ในสิ่งมีชีวิตนั้น
ที่มา : https://www.sahavicha.com/?name=knowledge&file=readknowledge&id=1049